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文献精选:神奇的MoDM,脑缺血后恢复的双刃剑!

07-16 论文查重

急性脑缺血也称为脑卒中,中风等,是现代社会中一类严重的威胁中老年人的急性临床综合征。目前,单核细胞衍生的巨噬细胞(MoDM)在中风后及其相关炎症反应中的作用以成为该领域的研究热点。一些研究表明,MoDM在中风后早期(1-5天)加重了炎症反应,加重了脑损伤;然而,与之相反的是,也有研究表明MoDM在脑缺血发生的后期(7-14天)促进了脑组织的功能恢复。今天笔者跟大家分享的这篇paper从经典的趋化因子CCR2入手,为大家详细剖析了MoDM在急性脑缺血中的作用及其相关机制。

 

众所周知,急性缺血性脑损伤和功能恢复主要由由神经炎症介导,单核细胞衍生的巨噬细胞(MoDM)是这种神经炎症的主要调节剂,然而其具体机制依然不明确。2018年,来自Theranostics的文章:CCR2-dependent monocytes/macrophages exacerbate acute brain injury but promote functional recovery after ischemic stroke in mice阐明了CCR2依赖性单核/巨噬细胞参与急性脑缺血及相关炎症反应的机制。还在等什么,快来一起看看吧!

 

1.CCR2 KO可预防急性脑损伤,但加重中风后延迟的损伤

作者通过中脑动脉闭塞手术(MCAO)建立急性脑缺血模型。TTC染色结果表明,CCR2 KO小鼠在MCAO后第3天梗塞尺寸明显高于野生型小鼠(Fig-1A),这表明CCR2 KO在中风后的急性期具有神经保护作用。甲酚/紫染色表明,在MCAO后较晚时间点(14和28天),与急性期的结果相反,CCR2 KO小鼠的脑萎缩显著大于WT小鼠(Fig-1B),表明其脑损伤程度更为严重。然后作者比较了MCAO后CCR2 KO和WT小鼠的死亡率,结果表明,与野生型小鼠相比,CCR2 KO小鼠在早期阶段死亡率较低(1-4天),但晚期阶段死亡率较高(Fig-1C)。

 

行为结果显示WT小鼠在旋转光束上行走的时间明显长于MCAO后2天和4天测量的CCR2 KO小鼠,但此后显示更快的恢复时间(Fig-1Da)。极点测试结果与光束测试结果类似(Fig-1Db-c), 表明CCR2 KO在中风后的急性期导致了神经保护,但在较晚时间点没有提供恢复。

 

2.迁移到缺血脑中的炎性单核细胞是CCR2依赖性的

作者通过使用流式细胞术鉴定MoDM(CD45hiCD11b+)和MiDM(CD45intCD11b+)(Fig-2A)。在中风后3天和7天测量的CCR2KO小鼠中的MoDM数量显著小于WT小鼠(Fig-2B)。然而,MiDM数量在CCR2KO小鼠和WT小鼠之间没有显着差异(Fig-2C)。

 

接下来,作者对缺血脑组织进行甲酚紫染色(Fig-2D),图中框内表示缺血核心区域,并在显微镜下采集照片(Fig-2E),结果表明,在第7天和第14天,CD68阳性细胞的数量在CCR2KO小鼠中显著低于WT小鼠(Fig-2F)。

 

然后作者比较了WT单核细胞与中风后血液中CCR2 KO单核细胞向缺血脑的迁移能力。将CCR2KO单核细胞与WT单核细胞分别用TRITC荧光染料(红色)和CFSE荧光染料(绿色)标记并混合,然后在中风后通过眼眶注射转移到动物体内。然后,作者分别从缺血性脑和外周血中的CD45hiCD11b + Ly6Chi和CD45 + CD11b + Ly6Chi细胞群中筛选出TRITC与CFSE阳性细胞(Fig-3A 3B)。

 

结果显示,与缺血脑中的WT单核细胞相比,CCR2KO单核细胞的单核细胞迁移率分别在第3天和第7天仅为0.24和0.25(Fig-3C),表明单核细胞迁移是CCR2依赖性的。

 

3.CCR2抑制剂丙帕锗(PG)与中风中CCR2 KO效果类似

作者使用PG处理WT小鼠并使用MRI来测量其梗塞面积。结果显示,PG处理后小鼠在第3天梗塞较小,但在第14天梗塞较大,表明PG具有与CCR2 KO类似的作用(Fig-4A)。

 

为了测试CCR2抑制是否改变动物行为,在中风后4天至14天施用PG。与CCR2 KO一样,PG处理导致中风后5至12天死亡率显著升高(Fig-4B),并且行为恢复受损(Fig-4C)。类似地,PG还在第7天和第14天显著抑制了CD68表达(Fig-4D)。

 

4.巨噬细胞在WT小鼠中风后的恢复阶段发生表型转变

PCR结果显示,WT小鼠缺血组织中的的促炎巨噬细胞基因在中风前期表达显着增加,但在后期表达下降。相反,抗炎巨噬细胞基因逐渐增加至7天,然后表达减少。而在CCR2 KO小鼠中,促炎巨噬细胞基因增加至7天,而抗炎巨噬细胞基因在中风后持续表达降低(Fig-5A)。

 

为了验证上述PCR结果,作者进一步使用流式细胞仪分选仪来分离MoDM用于基因表达定量。TNF-αmRNA在第3天至第5天显著升高,然后在第7天显著降低。相反,从3天开始观察到TGF-β1mRNA表达的显著增加,并且保持高表达至7天(Fig-5B)。

 

进一步的,作者通过流式细胞术研究了相关蛋白质表达。作者将CD45hiCD11b + Ly6G-Ly6Chi细胞群鉴定为为缺血性脑中的MoDM(Fig-5C)。与PCR结果一致,促炎巨噬细胞标记物(PD-L1和iNOS)在缺血性中风后第3天显著升高,然后在第7天下降,而抗炎巨噬细胞标记物(PD-L2和Arg-1)在缺血性中风后3至7天逐渐增加(Fig-5C)。

 

5.移植转移抗炎巨噬细胞促进中风后CCR2 KO小鼠的功能恢复

作者已经提供证据证明CCR2依赖性MoDM对促炎性和抗炎性巨噬细胞的神经炎症反应至关重要,因此作者推测抗炎性巨噬细胞可能对神经恢复至关重要。为了证明这一假设,在缺血性中风后4和6天将抗炎巨噬细胞或载体PBS移植转移到CCR2KO小鼠中。双重免疫染色表明,抗炎巨噬细胞的移植转移导致缺血脑中抗炎巨噬细胞表型(Ym-1)的增加(Fig-6A)。

 

并且增加的抗炎小胶质细胞/巨噬细胞也导致了较低的死亡率和神经恢复的改善(Fig-6B 6C)。

 

根据以上数据,作者得出结论:依赖CCR2的MoDM在缺血性中风中发挥双重作用,在中风早期引起更多损伤,同时促进晚期功能恢复。这些MoDM可通过促炎性表面转化为抗炎表型来实现其效果。

 

参考文献:

Fang W, Zhai X, Han D, et al. CCR2-dependent monocytes/macrophages exacerbate acute brain injury but promote functional recovery after ischemic stroke in mice[J]. Theranostics, 2018, 8(13): 3530.

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